溶菌酶的种类及其应用

  在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其它营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全的替代有害人体健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐等），以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。目前溶菌酶已作为一种防腐剂，大范围的应用于各种乳制品、肉制品、饮料及发酵食品中，欧洲已经用其代替亚硫酸盐作为防腐剂。

  溶菌酶本身是一种无毒、无害的蛋白质，且具有一定的保健作用，可以选择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其它物质，保证食品原有营养成分不受损失。对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副性微生物有特殊的杀灭作用，是婴儿食品中的抗菌蛋白，是一种必需的添加因子。溶菌酶在婴儿体内能直接或间接地促进婴儿肠道内双歧杆菌的增殖；能够在一定程度上促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，延长在肠道停滞时间，有利于婴儿消化吸收；能够在一定程度上促进人工喂养婴儿肠道细菌菌群的正常化；它还能够强化血清灭菌蛋白、r-球蛋白等体内防御因子，以增强对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻，预防消化器官疾病，增加体重的功效，是婴儿食品及配方奶粉等的良好添加剂[11]。溶菌酶特别适合于巴氏杀菌奶的防腐，一般在包装前加入300-600ppm。另外，在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以有效的预防中后期奶酪的后期起泡、风味变差及不影响奶酪老化过程中奶酪基液的品质，同时，还能起到抑菌作用，不至引起酪酸发酵，这是其它防腐剂所不能够比拟的。

  溶菌酶具有抗菌、抗病毒和消炎作用,与抗生素复合应用能增强抗生素疗效。它还是人体内的非特异性免疫因子,可提高机体的免疫力,并且与其他阳离子抗菌肽类天然防御因子有很好的协同作用[3]。另外,它本身是1种天然蛋白质,能在胃肠道作为营养的东西消化、吸收,无毒性,也不在体内残留,是1种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品[4]。溶菌酶常用于各种加工食品和饮料中,集药理、保健和防腐3种功能于一体[5]。

  用溶菌酶代替水杨酸用于日本清酒的防腐取得了很好的成效。清酒酒精含量为15%～17%（V/V），大部分微生物不能生存，但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长，并引起产酸和产生臭味[12]。以往通常加水杨酸作防腐剂，但因为水杨酸有一定毒性，其应用受到了限制。目前，日本已成功用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂，其加入量为15mg/kg[13]。此外，溶菌酶还可应用于pH6.0～7.5的饮料的防腐[14]。

  摘要：溶菌酶(Lysozyme Ec 3.2.17)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质,是一种无毒、无害、安全性很高的盐基水解蛋白酶。文章介绍了溶菌酶的来源、种类、抑菌机理,论述了溶菌酶在食品业、畜牧业、医药业中的应用,并展望了其发展及应用前景。

  人们从上世纪60年代发现微生物也产生溶菌酶,按其作用对象可分为两大类,即细菌溶菌酶和真菌溶菌酶。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下5种：①内N-乙酰己糖胺酶,此酶同于鸡蛋清溶菌酶,破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1.4糖苷键。②酰胺酶,切断细菌细胞壁肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。③内肽酶,使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。④β-1.3、β-1.6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,此酶分解酵母细胞的细胞壁。⑤壳多糖酶,这是分解霉菌细胞壁一种溶菌酶。

  溶菌酶能激活宿主的免疫系统，增强肿瘤细胞的免疫源性，从而具有抗肿瘤作用。溶菌酶是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pH环境下带有大量的正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脱辅盐基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。在被疱疹病毒感染的Hela细胞培养液中，加入溶菌酶后有抑制细胞变性作用。溶菌酶也可抑制腺病毒生长，可用于带状疱疹、腮腺炎、鸡水痘、肝炎及流感病毒性疾患的治疗。

  四川泡菜、豆瓣等是一类对热敏感的发酵食品，一般会用高盐或高酸抑菌方法贮藏。高温杀菌以及高盐、高酸等对食品风味的破坏作用较大；溶菌酶具有杀菌功效且无需加热，属于冷杀菌。谷绒等在实验室偿试了采用溶菌酶抑菌防腐特性对泡菜和豆瓣进行了杀菌防腐实验；根据结果得出，从感观上特别大程度上减少了发酵产品颜色褐变，保持了发酵原有的色泽；风味上大幅度的降低了泡菜和豆瓣的咸味，提高了产品风味；而成本上极大减少了食盐使用量，降低了产品的生产所带来的成本[15]。

  溶菌酶可作为冷鲜肉以及香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。在我们的日常生活中，肉类食品是一类必不可少的食物，为人体提供各种必需氨基酸和矿物质。然而肉类食品容易遭受各种微生物的侵害变质。溶菌酶的开发利用正好可以很好地解决这一问题。顾仁勇等研究之后发现：0.05％Nisin和0.05％溶菌酶混合液能有效延长猪肉的保鲜期，结合真空包装技术则保鲜效果更好[8]。张德权等选取Nisin、溶菌酶、乳酸钠、茶多酚、壳聚糖等5种天然保鲜剂对冷却羊肉进行保鲜处理，结果发现溶菌酶的保鲜效果优于乳酸钠、茶多酚、壳聚糖[9]。林琳等采用四种防腐剂保鲜红肠。根据结果得出：当以0.2%的山梨酸钾、4％的乳酸钠、0.04%的溶菌酶和0.05%Nisin复配时效果最好，且对红肠品质基本无影响[10]。

  在食品工业中，溶菌酶可当作婴儿食品的添加剂，大多数都用在牛乳的“人乳化”（尤其在欧洲）。人乳中含有大量的溶菌酶，而牛乳中则甚少，将溶菌酶添加至牛乳或其乳制品中，可改良牛乳品质,抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖[6]。在乳粉或鲜乳中添加溶菌酶后，不仅能起到防腐保鲜和延长保存期的作用，而且还有利于婴儿肠道细菌正常化，增强婴儿的免疫力。此外，溶菌酶对牛奶中革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等作用非常强。由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬间杀菌奶，其方法为在包装前添加或在杀菌前添加。每吨牛奶加入0.05～0.1mg溶菌酶，37℃保温3h，可使牛奶中双歧杆菌的含量与人奶无显著差别，从而保证婴儿肠道内双歧杆菌的良好增殖。在半硬干酪中加入0.001%的溶菌酶，可防止香味物质丁酸的损失，同时能阻止由于厌氧孢子增殖体（如酪梭杆菌）的作用所引起的胀气等[7]。

  作为非特异性免疫的重要成员，溶菌酶在防御外源微生物入侵方面发挥重要的作用，其在动物的免疫细胞和巨噬细胞中含量比较高。后来在反刍动物的皱胃中发现消化型溶菌酶，此类溶菌酶能消化分解细菌，并吸收微生物分解后的组分来作为自身的营养成分。溶菌酶对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成的菌、枯草杆菌和耐辐射微球菌均具有良好的分解作用，对大肠杆菌、普通变球菌和副血性弧菌等革兰氏阴性菌也具有溶解作用。细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖。多糖之间以直链形式存在，彼此临近的多糖链之间可以通过肽链部分相互连接，从而形成三维结构。溶菌酶正是通过水解破坏组成细菌细胞壁的肽糖分子的由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖氨之间的β-（1,4）糖苷键，使细胞因渗透压不平衡引起破裂，从而导致菌体细胞壁溶解而杀死细菌。

  鸡蛋白中约含有3.5%的溶菌酶,可分解革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌不起作用,其分子量为14000。此外,从其他鸟类蛋白、哺乳动物乳汁及体液中也分离到了溶菌酶。

  研究人员对116科410种植物进行普查,发现168种植物中含有溶菌酶。其中木瓜、无花果,大麦等植物中均可分离出溶菌酶,其分子量较大,约为24000～29000,其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋白溶菌酶的1/3。

  溶菌酶在茶饮料生产上也有很好的应用前景。茶汤属于低酸性饮料，引起茶饮料变质的微生物主要为细菌。为保证饮料安全及贮藏性，必须对茶饮料进行杀菌处理。常规方法处理后对其品质和风味影响很大。但是，溶菌酶在低酸茶饮料中仍然保持较高的抑菌活性，并且不会影响饮料口味，是一种理想的茶饮料防腐剂。在pH值为6.0―7.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶，具有较好的防腐作用。此外，溶菌酶还可作为料酒和葡萄酒的防腐剂和澄清剂。

  溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质，且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血作用，有组织再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。

  在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶可以抑制微生物的繁殖[16]；在生面条、花生酱和色拉等食品中加入溶菌酶，均能够更好的起到良好的防腐保鲜作用。章银良利用溶菌酶对草莓进行保鲜时发现草莓的保鲜期明显延长[17]。

  溶菌酶( lysozyme,EC3.2.1.17)又称细胞壁质酶(muramid-ase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycano-hydralase)。最早对溶菌酶的研究起于Nicolle 1907年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年Fleming等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶[1]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。1965年,英国的菲利普等用X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构[2]。它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.3%)。在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。

  目前，溶菌酶的开发利用还有许多不足之处。由于溶菌酶主要对革兰氏阳性菌有溶菌作用，而对革兰氏阴性菌的作用较弱[18]；溶菌酶作用的特异性高，只对特定的微生物或者微生物的一定生长期起作用；有些溶菌酶虽能分解某些活体细菌，但对该菌的芽胞却不起任何作用；另外，溶菌酶的抑菌活性还要受食品的pH值、温度、盐浓度，向食品中添加溶菌酶的时间、方法和溶菌酶作用的有效条件等因素的影响。并且，人溶菌酶与其它生物溶菌酶在特征序列上存在一定的差别，将溶菌酶直接作为食品防腐剂，尤其是婴儿食品，有一定的风险性，会造成人们Baidu Nhomakorabea食物的变态反应。除此之外，溶菌酶的价格比其他化学杀菌剂高。这些都使得它的应用受到限制。但这些都不能限制溶菌酶作为一种有效的绿色食品防腐剂的开发与研究。许多研究人员目前正致力于人溶菌酶的克隆表达，目的是生产出更适合人类使用的安全食品防腐剂。如，刘思国已成功将重组人溶菌酶基因组DNA和cDNA转染入山羊胎儿成纤维细胞内，克隆出能高效表达人溶菌酶的克隆山羊[19]；张勃伟等也成功构建了人溶菌酶真核表达载体，并从基因水平研究了人溶菌酶基因在体外培养的牛乳腺上皮细胞中的表达[20]；C.Scaman等研究人员通过化学或酶修饰法来改进溶菌酶的抗菌活性及功能特性[21]；Van等利用重组DNA技术来改善溶菌酶对产品的保鲜效果，以便来扩大它在食品保鲜方面的应用场景范围[22]。马美湖等利用溶菌酶、乳酸菌肽进行了冷却肉保鲜的实验研究,发现当两种保鲜剂单独使用时，溶菌酶的保鲜效果明显地优于对照组，也优于乳酸链球菌肽组[23]。在应用溶菌酶作为食品防腐剂时，一定要注意到酶的专一性。对于酵母、霉菌和革兰氏阴性菌等引起的腐败变质，溶菌酶不能起到非常好的防腐作用。但溶菌酶有良好的配伍性，可与其他添加剂（如同植酸、甘氨酸、聚合磷酸盐等）复配使用，从而大幅度的提升其防腐保鲜的效果。